1.1 Toxikológia

1990 előtt nem történtek olyan vizsgálatok a világban, amelyek a deutériummegvonás hatását toxikológiai szempontból vizsgálták volna. Annak biztonságos eldöntésére, hogy a csökkentett deutériumtartalmú víz (DDW) alkalmazása kiválthat-e toxikus hatást humán alkalmazás esetén, a következõ vizsgálatokat végeztük el:

• In vitro szövettenyészeteken végzett kísérlet során vizsgáltuk a sejtek kolóniaképző képességét, emellett mikroszkóposan ellenőriztük, hogy a deutériummegvonás eredményeképpen bekövetkezik-e bármilyen morfológiai változás a sejtekben. Az eredmények azt igazolták, hogy sem a csökkentett (35 ppm), sem pedig az emelt (300 ppm) deutériumtartalom nem befolyásolta a sejtek letapadási, kolóniaképző és szaporodási képességét toxikus szinten, vagyis a csökkentett deutériumtartalmú víz alkalmazása nem jár toxikus mellékhatással.
• Az amerikai Oncotech cég Differential Staining Cytotoxicity Assay (DiSC^TM) rendszerében vizsgálta a DDW citotoxikus hatását a kezeletlen kontrollsejtekhez viszonyítva. A vizsgálat során a daganatsejtek morfológiai vizsgálatát végezték mikroszkóposan. A DiSC vizsgálat azt igazolta, hogy a tápfolyadék deutériumtartalmának lépcsõzetes csökkentése 96 órás követés során nem volt hatással petefészek- és emlőkarcinoma-sejtek túlélésére a kontrollhoz képest; ez azt igazolta, hogy a DDW-nek nincs sejttoxikus hatása ezekre a daganatsejtekre.
• In vivo toxicitási vizsgálatot végeztünk a GLP elveknek megfelelően; összehasonlítottuk a kezelt és a kontrollcsoport egereinek víz- és táplálékfelvételét, illetve súlygyarapodását. Három hónap után leöltük a laboratóriumi állatokat mindkét csoportban, és összehasonlító patológiai vizsgálatot végeztünk. Az állatok boncolása során nem tapasztaltunk semmilyen makroszkópos eltérést a kezelt csoport állataiban a kontrollhoz képest.
• Mutagenitásvizsgálat: a kísérlet során a gyógyszeriparban általánosan használt Ames teszt segítségével vizsgáltuk a DDW esetleges mutagén hatását. A vizsgálatokat 90-95 ppm-es DDW-ral végeztük. A vizsgálat eredménye szerint a DDW alkalmazása nem okozott eltérést a vizsgált baktériumok mutációs gyakoriságában.
• Klinikai eredmények: a preklinikai vizsgálatokat követõen 1995-ben humán Fázis II. klinikai vizsgálat indult. Már az 1997-ben elvégzett köztes értékelés igazolta, hogy a kezelt csoportba tartozó betegek esetében semmilyen mellékhatás nem figyelhető meg. Sem a fehérvérsejtszám csökkenését, sem egyéb szignifikáns eltérést nem tapasztaltak a kezelt csoportban, amelyet a DDW alkalmazásának lehetett volna tulajdonítani 150-400 liter DDW elfogyasztása után.

A csökkentett deutériumtartalmú víz alkalmazása nem veszélyezteti a betegeket, alkalmazása biztonságos, és a kockázati arány rendkívül alacsony.

1.2 Hatékonyság

1.2.1 In vitro vizsgálatok

• A DDW in vitro vizsgálata különbözõ sejtvonalakon
  Annak tisztázására, hogy a deutériumhiány hatással van-e a sejtek szaporodására, először L929 egészséges fibroblaszt sejtvonal szaporodását vizsgáltuk csökkentett deutériumtartalmú tápfolyadékban. Az eredmények azt igazolták, hogy normál tápfolyadék csökkentett deutériumtartalmú tápfolyadékra történõ cseréje 15-20 órás késést idézett elő a sejtek osztódásában. Hasonló eredményt kaptunk A4 sejtvonal esetében is. Szintén A4 sejtvonalon vizsgáltuk, hogy a deutérium megvonásával indukálható-e a programozott sejthalál (apoptózis). A kísérlet során A4 interleukindependens sejtvonal apoptózisának stimulációját figyeltük meg csökkentett deutériumtartalmú tápfolyadékban.
• Annak érdekében, hogy további bizonyítékokat szerezzünk a DDW sejtosztódást gátló hatására, a DNS-szintézist vizsgáltuk 3H-Thymidine-beépülés mérése alapján. Három különbözõ daganatos sejtvonal (MCF-7, emlő; PC-3, prosztata; M14, melanoma) vizsgálata alapján az alábbi következtetések vonhatók le:
  • A DDW mindhárom sejtvonal esetében gátolta a sejtosztódást.
  • A gátlás a tápfolyadékcserét követő 1-6 óra múltán jelentkezett, és 24-48 óra múltán megszűnt.
  • A sejtvonalak érzékenysége eltérő volt úgy a gátlás időtartamának, mint a gátlás mértékének a vonatkozásában.
  • A DNS-szintézis gátlása kifejezettebb volt G0/G1 fázisban szinkronizált sejtek esetében a nem szinkronizált sejtekhez viszonyítva.
  • A dózishatás egyértelmű volt; minél alacsonyabb volt a tápfolyadék D-koncentrációja, annál erősebb gátlást tapasztaltak.
  • Rövidebb-hosszabb idő elteltével a sejtek alkalmazkodtak az alacsony deutériumtartalomhoz; ezt követően nem volt különbség a sejtvonalak között.
• A deutériumkoncentráció fokozatos csökkentése megnövelte a gátló hatás időtartamát 1-6 óráról legalább 72 órára, és a szaporodási ráta 15-20%-os gátlása 40-50%-ra nőtt. Ez az eredmény egyértelműen azt igazolja, hogy a tápfolyadék deutériumtartalmának lépcsőzetes csökkentésével a DDW gátló hatása fokozható. Hasonló folyamat játszódik le az állatok és az ember szervezetében a DDW fogyasztása során, amikor a szervezet deutériumtartalma fokozatosan csökken.
  

1.2.2 Állatkísérletek

A DDW humán emlőtumor regresszióját idézte elő egerekben

A DDW tumornövekedésre gyakorolt hatásának in vivo vizsgálatára humán emlőtumort ültettünk be immunszupresszált egerekbe. A legelső vizsgálatok során a transzplantációt követõ 80. napon 17 tumoros egérből 10-ben visszafejlődtek, majd eltűntek a tumorok (59%) (1. táblázat).

1. táblázat
A deutériumdepléció hatása CBA/Ca egerek túlélésére humán emlőtumorral történt
xenotranszplantációt követően

a Az oszlop a transzplantáció után eltelt napokat mutatja
b Az adatok a tumoros állatok arányát mutatják a teljes egyedszámhoz képest

• A DDW lelassította humán prosztatatumor növekedését egerekben

Ebben a kísérletben daganatos humán prosztatasejteket ültetünk be 44 CBA/Ca egérbe. A kezelés 32 nappal a transzplantációt követően indult, a kezelt állatokkal 94±5 ppm deutériumtartalmú vizet itattunk. A kezelés kezdetekor az átlagos tumortérfogat 1,2 cm³ volt a kontroll- és a kezelt csoportban egyaránt. A 2. táblázatban az átlagos tumortérfogat-értékek alakulását mutatjuk be a kezelés folyamán. Az értékek jól mutatják, hogy a kezelt csoportban a tumor növekedési üteme lelassul a normál ivóvíz csökkentett deutériumtartalmú ivóvízre történő cseréje után.

2. táblázat
A DDW hatása a tumornövekedésre PC-3 humán prosztatatumorral
transzplantált CBA/Ca egereknél

• A DDW apoptózist indukál PC-3 humán prosztatatumorral transzplantált egerekben

A vizsgálat során a deutériumdepletio mitózisra gyakorolt hatását kívántuk vizsgálni. CBA/Ca egereket humán PC-3 prosztatasejtvonallal transzplantáltunk. A DDW-kezelés a transzplantációt követő 18. napon indult. Tizenkét nappal később az állatokat leöltük, és a tumorokat mikroszkóposan megvizsgáltuk. A mitózisban és apoptózisban lévő sejteket számláltuk. Azt találtuk, hogy a kontrollcsoportban, ahol az egerek normál (150 ppm) deutériumtartalmú ivóvizet kaptak, a sejtek 3,6%-a volt mitózisban, és mindössze 1%-a apoptózisban. A kezelt csoportban, amely DDW-t fogyasztott ivóvízként, az arány csaknem fordított volt, a sejtek 1,5%-a volt mitózisban, ellenben 3%-a apoptózisban. Az eredmények igazolják, hogy a DDW szignifikáns változásokat indukál a tumorokban, a daganatos sejtek rendkívül érzékenyek a deutériumdepletióra, mely apoptózisukhoz vezet.

• A DDW spontán tumorok teljes vagy részleges regresszióját okozza kutyákban és macskákban

A DDW-kezelt állatok különbözõ típusú tumorokban szenvedtek (lymphoid leucosis, emlőtumor, epithelioma, diffúz seminoma), ennek ellenére a tumorok kedvezően reagáltak a DDW-kezelésre néhány héten vagy hónapon belül, a tumor fajtájának és méretének függvényében (3. táblázat.). A tumortípust minden esetben szövettanilag igazolták, és követték a tumor méretét. Az eredmények bizonyítják, hogy a DDW nem egy bizonyos tumorfajtára specifikus, hanem általában hatékony, azonban a tumorfajták érzékenysége eltérő lehet.

3. táblázat
A deutériumdepletio hatása állati tumorokra in vivo
(* CR - teljes válasz, PR - részleges válasz, NC - nincs változás, PD - a betegség romlása)

Az első, kísérletbe bevont lymphoid leucosisos macska esetleírása:

1994 májusában egy gyenge, lesoványodott, köhögő macskát vittek be az állatkórházba. Az eltávolított nyirokcsomóból szövettani vizsgálat készült, mely lymphoid leucosist igazolt. Az állatkórházban a macska néhány hetes túlélését prognosztizálták. Az állatot benntartották a kórházban, ahol a DDW-t eleinte fecskendőből adagolták. A kezdetben gyenge, lesoványodott macska a kezelés nyomán önállóan táplálkozni kezdett, megélénkült. Súlya gyarapodott, általános állapota folyamatosan javult. Háromhetes kezelés után a macskát hazaengedték, kezelését otthon folytatták. 1994 novemberében a leucosis tényét már nem lehetett visszaigazolni. A macska évek múltán is egészséges.

Egészen mostanáig a lymphoid leucosist gyógyíthatatlan betegségként tartották számon a macskáknál, minden esetben az állatok elhullását okozta.

A DDW preventív hatása

Az eljárás preventív hatását hosszú távú állatkísérletben vizsgálva 48 egeret kezeltünk olyan kémiai rákkeltő ágenssel (DMBC), melynek hatására fél éven belül megjelennek a daganatok, és ezzel párhuzamosan megindul az állatok elhullása. A daganat indukcióját követően az állatokat két, 24-24 egyedet tartalmazó csoportra osztottuk, az egyik csoportot normál (kontroll csoport), a másikat Dd-vízzel (kezelt csoport) kezdtük itatni. A 4. ábrából kitűnik, hogy a kontrollcsoportban az állatok elhullása az első félévet követően folyamatos volt, az állatok 75%-a (18 állat) 270 napon belül elpusztult az indukció nyomán spontán megjelenő tüdő-, vese-, májdaganatban, illetve leukémiában. Ezzel szemben a kezelt csoportban a kezelést követő 150. és 330. nap között csak 2 állat hullott el (8%), és a kísérlet lezárásáig (370 nap) is csak 12 állat pusztult el daganatos betegség miatt. A kezelt csoportban jelentősebb elhullás több mint 200 nappal később következett be, mint a kontrollcsoportban, ami emberre vetítve azt jelentheti, hogy 15-20 évvel lehet késleltetni a daganatok megjelenését a csökkentett deutériumtartalmú víz alkalmazásával.

4. ábra
Kémiai karcinogénnel kezelt egerek túlélési görbéje